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आनुवंशिक रूप से इंजीनियर प्रोटीन. स्थानीयकृत उत्परिवर्तन और प्रोटीन इंजीनियरिंग। प्रोटीन इंजीनियरिंग रणनीतियाँ

1.1 प्रोटीन इंजीनियरिंग की अवधारणा। विकास का इतिहास

प्रोटीन इंजीनियरिंग जैव प्रौद्योगिकी की एक शाखा है जो उपयोगी या मूल्यवान प्रोटीन के विकास से संबंधित है। यह एक अपेक्षाकृत नया अनुशासन है जो प्रोटीन तह के अध्ययन और प्रोटीन संशोधन और निर्माण के सिद्धांतों पर केंद्रित है।

प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए दो मुख्य रणनीतियाँ हैं: निर्देशित प्रोटीन संशोधन और निर्देशित विकास। ये विधियाँ परस्पर अनन्य नहीं हैं; शोधकर्ता अक्सर दोनों का उपयोग करते हैं। भविष्य में, प्रोटीन संरचना और कार्य का अधिक विस्तृत ज्ञान, साथ ही उच्च प्रौद्योगिकी में प्रगति, प्रोटीन इंजीनियरिंग की संभावनाओं का महत्वपूर्ण रूप से विस्तार कर सकती है। परिणामस्वरूप, एक नई विधि की बदौलत अप्राकृतिक अमीनो एसिड को भी शामिल किया जा सकता है जो नए अमीनो एसिड को आनुवंशिक कोड में शामिल करने की अनुमति देता है।

प्रोटीन इंजीनियरिंग की उत्पत्ति प्रोटीन भौतिकी और रसायन विज्ञान और जेनेटिक इंजीनियरिंग के चौराहे पर हुई। यह निर्दिष्ट विशेषताओं के साथ संशोधित या संकर प्रोटीन अणु बनाने की समस्या का समाधान करता है। इस तरह के कार्य को लागू करने का एक प्राकृतिक तरीका परिवर्तित प्रोटीन को एन्कोड करने वाले जीन की संरचना की भविष्यवाणी करना, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में इसके संश्लेषण, क्लोनिंग और अभिव्यक्ति को पूरा करना है।

पहला नियंत्रित प्रोटीन संशोधन 60 के दशक के मध्य में कोशलैंड और बेंडर द्वारा किया गया था। प्रोटीज़, सबटिलिसिन के सक्रिय केंद्र में हाइड्रॉक्सिल समूह को सल्फहाइड्रील समूह से बदलने के लिए, उन्होंने एक रासायनिक संशोधन विधि का उपयोग किया। हालाँकि, जैसा कि यह निकला, ऐसे थायोलसुबटिलिसिन प्रोटीज गतिविधि को बरकरार नहीं रखता है।

रासायनिक रूप से, प्रोटीन एक प्रकार का अणु है, जो एक पॉलीएमिनो एसिड श्रृंखला या बहुलक है। यह 20 प्रकार के अमीनो एसिड अनुक्रमों से बना है। प्रोटीन की संरचना जानने के बाद, लोगों ने सवाल पूछा: क्या पूरी तरह से नए अमीनो एसिड अनुक्रमों को डिजाइन करना संभव है ताकि वे सामान्य प्रोटीन की तुलना में मनुष्यों के लिए आवश्यक कार्यों को बेहतर तरीके से कर सकें? इस विचार के लिए प्रोटीन इंजीनियरिंग नाम उपयुक्त था।

ऐसी इंजीनियरिंग के बारे में लोगों ने 20वीं सदी के 50 के दशक में सोचना शुरू किया था। यह पहले प्रोटीन अमीनो एसिड अनुक्रम को समझने के तुरंत बाद हुआ। दुनिया भर की कई प्रयोगशालाओं में, प्रकृति की नकल करने और बिल्कुल मनमाने ढंग से दिए गए पॉलीएमिनो एसिड अनुक्रमों को रासायनिक रूप से संश्लेषित करने का प्रयास किया गया है।

रसायनशास्त्री बी. मेरिफ़ील्ड इसमें सबसे अधिक सफल हुए। यह अमेरिकी पॉलियामिनो एसिड श्रृंखलाओं के संश्लेषण के लिए एक अत्यंत प्रभावी विधि विकसित करने में कामयाब रहा। इसके लिए मेरिफील्ड को 1984 में रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया था।

चित्र 1. प्रोटीन इंजीनियरिंग कैसे काम करती है इसकी योजना।

अमेरिकी ने हार्मोन सहित छोटे पेप्टाइड्स को संश्लेषित करना शुरू किया। उसी समय, उन्होंने एक ऑटोमेटन - एक "रासायनिक रोबोट" बनाया - जिसका कार्य कृत्रिम प्रोटीन का उत्पादन करना था। रोबोट ने वैज्ञानिक हलकों में सनसनी फैला दी। हालाँकि, यह जल्द ही स्पष्ट हो गया कि उनके उत्पाद प्रकृति द्वारा उत्पादित चीजों से प्रतिस्पर्धा नहीं कर सकते।

रोबोट अमीनो एसिड अनुक्रमों को सटीक रूप से पुन: पेश नहीं कर सका, यानी उसने गलतियाँ कीं। उन्होंने एक श्रृंखला को एक अनुक्रम के साथ संश्लेषित किया, और दूसरे को थोड़ा संशोधित के साथ संश्लेषित किया। एक कोशिका में, एक प्रोटीन के सभी अणु आदर्श रूप से एक-दूसरे के समान होते हैं, अर्थात उनका क्रम बिल्कुल समान होता है।

एक और समस्या थी. यहां तक कि वे अणु जिन्हें रोबोट ने सही ढंग से संश्लेषित किया था, उन्होंने एंजाइम के कार्य करने के लिए आवश्यक स्थानिक रूप नहीं लिया। इस प्रकार, प्रकृति को कार्बनिक रसायन विज्ञान के सामान्य तरीकों से बदलने के प्रयास से बहुत मामूली सफलता मिली।

प्रोटीन के आवश्यक संशोधनों की तलाश में वैज्ञानिक केवल प्रकृति से ही सीख सकते थे। यहां मुद्दा यह है कि प्रकृति में लगातार उत्परिवर्तन होते रहते हैं जिससे प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम में परिवर्तन होता है। यदि आप आवश्यक गुणों वाले उत्परिवर्ती का चयन करते हैं जो किसी विशेष सब्सट्रेट को अधिक कुशलता से संसाधित करते हैं, तो आप ऐसे उत्परिवर्ती से एक परिवर्तित एंजाइम को अलग कर सकते हैं, जिसके लिए कोशिका नए गुण प्राप्त करती है। लेकिन इस प्रक्रिया में बहुत लंबा समय लग जाता है.

जब जेनेटिक इंजीनियरिंग सामने आई तो सब कुछ बदल गया। उसके लिए धन्यवाद, उन्होंने किसी भी न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के साथ कृत्रिम जीन बनाना शुरू किया। इन जीनों को तैयार वेक्टर अणुओं में डाला गया और डीएनए को बैक्टीरिया या यीस्ट में डाला गया। वहां कृत्रिम जीन से आरएनए की एक प्रति ली गई। परिणामस्वरूप, आवश्यक प्रोटीन का उत्पादन हुआ। इसके संश्लेषण में त्रुटियों को बाहर रखा गया। मुख्य बात सही डीएनए अनुक्रम का चयन करना था, और फिर कोशिका की एंजाइम प्रणाली ने अपना काम त्रुटिहीन तरीके से किया। इस प्रकार, हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि जेनेटिक इंजीनियरिंग ने अपने सबसे मौलिक रूप में प्रोटीन इंजीनियरिंग का रास्ता खोल दिया है।

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एफिमोव ग्रिगोरी अलेक्जेंड्रोविच। टीएनएफ के खिलाफ पुनः संयोजक एंटीबॉडी पर आधारित नए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर प्रोटीन: शोध प्रबंध... जैविक विज्ञान के उम्मीदवार: 01/03/03 / एफिमोव ग्रिगोरी अलेक्जेंड्रोविच; [रक्षा का स्थान: वी.ए. एंगेलहार्ड इंस्टीट्यूट ऑफ मॉलिक्यूलर बायोलॉजी आरएएस]। - मॉस्को, 2015। - 122 एस.

परिचय

साहित्य समीक्षा 9

1. टीएनएफ 9 की खोज का इतिहास

2. टीएनएफ 10 सुपरफैमिली

3. सिस्टम संरचना tnfnfr 12

4. कार्य टीएनएफ 15

5. रुमेटीइड गठिया और अन्य ऑटोइम्यून बीमारियों के रोगजनन में टीएनएफ की भूमिका 16

6. चिकित्सीय अवरोधन टीएनएफ 18

7. एंटीइन्फ थेरेपी के दुष्प्रभाव और सीमाएं 23

8. टीएनएफ ब्लॉकिंग 25 के लिए नए दृष्टिकोण और संभावनाएं

सामग्री और अनुसंधान विधियाँ 29

1. मानव टीएनएफ के लिए एक नए ऊंट एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन और लक्षण वर्णन 29

एकल डोमेन एंटीबॉडी Vhh41 29 की अभिव्यक्ति और शुद्धि

एलिसा 30 द्वारा मानव टीएनएफ के साथ वीएचएच41 एंटीबॉडी के बंधन का मूल्यांकन

सतह प्लाज्मा अनुनाद विधि 31 का उपयोग करके वीएचएच41 और मानव टीएनएफ के बीच बातचीत का अध्ययन

मानव TNF 31 को अवरुद्ध करने के लिए Vhh41 की क्षमता पर अध्ययन

2. टीएनएफ फ्लोरोसेंट सेंसर के हाइब्रिड प्रोटीन का डिजाइन, तैयारी और लक्षण वर्णन 32

टीएनएफ सेंसर को एन्कोडिंग करने वाले जीन का निर्माण। 32

टीएनएफ फ्लोरोसेंट सेंसर की अभिव्यक्ति और शुद्धि। 33

पुनः संयोजक टीएनएफ के साथ Vhh41-K की बातचीत का विश्लेषण। 34

इन विट्रो और विवो में Vhh41-KTNFin फ्लोरोसेंट सेंसर के जैविक गुणों का अध्ययन। Z5

विवो 36 में टीएनएफ को बांधने के लिए एक फ्लोरोसेंट सेंसर की क्षमता का अध्ययन

प्राप्त फ्लोरोसेंट सेंसर का उपयोग करके टीएनएफ अभिव्यक्ति का इंट्राविटल अध्ययन...39

3. एकल-श्रृंखला ANTINF एंटीबॉडी की तैयारी और लक्षण वर्णन 40

माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी F10 40 का अध्ययन

एकल श्रृंखला एंटीबॉडी AHT-4 41 का निर्माण और अभिव्यक्ति

एकल श्रृंखला एंटीबॉडी AHT-4 42 की जैविक गतिविधि का मापन

4. काइमेरिक एंटीइन्फ एंटीबॉडी 43 की तैयारी और लक्षण वर्णन

5. विशिष्ट एंटीबॉडी A9 और MA9 43 का निर्माण, उत्पादन और लक्षण वर्णन

एंटीबॉडी A9 और tA9 का निर्माण, अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण विधि का उपयोग करके पुनः संयोजक मानव TNF के साथ एंटीबॉडी A9 और tA9 की सहभागिता

सतह प्लाज्मा अनुनाद 44

साइटोटोक्सिक परीक्षण 45

साइटोफ्लोरोमेट्री 45

मानव TNF को बनाए रखने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी A9 की क्षमता का मूल्यांकन

मैक्रोफेज की सतह 45

6. मैक्रोफेज टीएनएफ के प्रणालीगत और चयनात्मक अवरोधन की प्रभावशीलता का तुलनात्मक मूल्यांकन 46

जेआईआईजेसी/डी-गैलेक्टोसामाइन 46 के प्रशासन द्वारा प्रेरित तीव्र हेपेटोटॉक्सिसिटी का मॉडल

परिणाम एवं चर्चा 48

1. एक नए पुनः संयोजक एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन और लक्षण वर्णन जो विशेष रूप से मानव टीएनएफ से बंधता है, लेकिन इसकी जैविक गतिविधि को अवरुद्ध नहीं करता है 50

एक पुनः संयोजक एकल-डोमेन एंटीबॉडी को एन्कोडिंग करने वाले आनुवंशिक निर्माण का निर्माण

पुनः संयोजक एकल डोमेन एंटीबॉडी Vhh41 52 की अभिव्यक्ति और शुद्धि

मानव TNF 53 के साथ एकल-डोमेन एंटीबॉडी Vhh41 की बातचीत का विश्लेषण

मानव TNF.54 की जैविक गतिविधि को अवरुद्ध करने के लिए Vhh41 एंटीबॉडी की क्षमता का विश्लेषण

2. एकल डोमेन पुनः संयोजक एंटीबॉडी और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन 56 के आधार पर टीएनएफ अभिव्यक्ति के इंट्राविटल अध्ययन के लिए टीएनएफ आणविक सेंसर का डिजाइन, उत्पादन और लक्षण वर्णन

टीएनएफ फ्लोरोसेंट सेंसर Vhh41-Ku को एन्कोडिंग करने वाले आनुवंशिक निर्माण की तैयारी

संलयन प्रोटीन को नियंत्रित करें 56

TNF फ्लोरोसेंट सेंसर Vhh41-K की अभिव्यक्ति और शुद्धि। 57

पुनः संयोजक माउस टीएनएफ के साथ टीएनएफ फ्लोरोसेंट सेंसर Vhh41-K की बातचीत का विश्लेषण

और व्यक्ति 58

इन विट्रो और विवो में फ्लोरोसेंट सेंसर TNF Vhh41-Kin के जैविक गुणों का अध्ययन। 61

विवो 66 में टीएनएफ को बांधने के लिए एक फ्लोरोसेंट सेंसर की क्षमता का अध्ययन

प्राप्त फ्लोरोसेंट सेंसर का उपयोग करके टीएनएफ अभिव्यक्ति का इंट्राविटल अध्ययन... 69

3. एक पुनः संयोजक एकल-श्रृंखला एंटीबॉडी की तैयारी और लक्षण वर्णन जो टीएनएफ 72 की जैविक गतिविधि को अवरुद्ध करता है

माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी F10 72 की गतिविधि का मापन

फेफड़ों के परिवर्तनीय टुकड़ों के आधार पर एकल-श्रृंखला एंटीबॉडी का निर्माण और

माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एफ 10 74 की भारी श्रृंखलाएं

एकल श्रृंखला एंटीबॉडी गतिविधि AHT-4 75 का मापन

4. मानव टीएनएफ के विरुद्ध काइमेरिक एंटीबॉडी का विकास और विश्लेषण

काइमेरिक एंटीबॉडी 13239 और इन्फ्लिक्सिमैब की परस्पर क्रिया की गतिकी की तुलना

पुनः संयोजक मानव टीएनएफ 77 काइमेरिक एंटीबॉडी 13239 की निष्क्रिय गतिविधि की तुलना गतिविधि के साथ

इन्फ्लिक्सिमैब इन विट्रो 79

काइमेरिक एंटीबॉडी 13239 80 की विवो गतिविधि परख में

5. मोनोसाइट-मैक्रोफेज श्रृंखला 82 की कोशिकाओं द्वारा उत्पादित चयनात्मक टीएनएफ अवरोधक का डिजाइन, उत्पादन और लक्षण वर्णन

आणविक क्लोनिंग, विशिष्ट एंटीबॉडी की अभिव्यक्ति और शुद्धि 82

पुनः संयोजक मानव टीएनएफ 86 के साथ एंटीबॉडी ए9 और टीए9 की परस्पर क्रिया

एंटीबॉडी ए9 और टीए9 87 द्वारा इन विट्रो में टीएनएफ-निर्भर साइटोटॉक्सिसिटी को अवरुद्ध करना

बातचीत के माध्यम से मैक्रोफेज की सतह पर एंटीबॉडी ए9 और टीए9 के बंधन का विश्लेषण

सतह अणु F4/80 89

मैक्रोफेज की सतह पर अंतर्जात रूप से उत्पादित मानव टीएनएफ का प्रतिधारण

विशिष्ट एंटीबॉडी A9 93

6. विवो 96 में मोनोसाइट-मैक्रोफेज वंश की कोशिकाओं द्वारा उत्पादित टीएनएफ का शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण चयनात्मक अवरोधन

मोनोसाइट-मैक्रोफेज वंश की कोशिकाओं द्वारा उत्पादित टीएनएफ के लक्षित अवरोधन और तीव्र मॉडल में टीएनएफ के प्रणालीगत अवरोधन की प्रभावशीलता का तुलनात्मक मूल्यांकन

हेपेटोटॉक्सिसिटी 96

निष्कर्ष 99

सन्दर्भ 100

रुमेटीइड गठिया और अन्य ऑटोइम्यून बीमारियों के रोगजनन में टीएनएफ की भूमिका

एंटी-साइटोकिन थेरेपी के साथ पहला अनुभव 1985 में किया गया था, जब चूहों को पॉलीक्लोनल एंटी-एनएफ खरगोश सीरम दिया गया था, जिसने एलपीएस प्रशासन द्वारा प्रेरित घातक हेपेटोटॉक्सिसिटी के विकास को रोका था। बंदरों में भी इसी तरह के परिणाम प्राप्त हुए: मानव टीएनएफ के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ इलाज किए गए बबून ई. कोली की घातक खुराक के अंतःशिरा इंजेक्शन से बच गए [104]।

पहला चिकित्सीय टीएनएफ अवरोधक मानव टीएनएफ से प्रतिरक्षित चूहों से प्राप्त उच्च-आत्मीयता म्यूरिन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी ए 2 के आधार पर विकसित किया गया था। क्योंकि अन्य प्रकार के एंटीबॉडी में अमीनो एसिड अनुक्रम में महत्वपूर्ण अंतर होता है, वे मनुष्यों में दीर्घकालिक चिकित्सीय उपयोग के लिए अनुपयुक्त होते हैं। इसलिए, जेनेटिक इंजीनियरिंग का उपयोग करके, भारी और हल्की श्रृंखलाओं के माउस स्थिर डोमेन को मानव के साथ बदल दिया गया। एंटीजन को बांधने वाले परिवर्तनशील क्षेत्र अपरिवर्तित रहे। ऐसे एंटीबॉडीज को काइमेरिक कहा जाता है। इसके बाद, टीएनएफ के खिलाफ इस पहले चिकित्सीय एंटीबॉडी को अंतरराष्ट्रीय गैर-मालिकाना नाम - इन्फ्लिक्सिमैब प्राप्त हुआ।

एंटीएनएफ थेरेपी के लिए आवेदन के सबसे स्पष्ट क्षेत्रों में से एक सेप्सिस का उपचार रहा है। हालाँकि, नैदानिक अध्ययनों ने महत्वपूर्ण परिणाम नहीं दिखाए हैं, जो स्पष्ट रूप से इस तथ्य के कारण है कि जब तक सेप्सिस की नैदानिक तस्वीर विकसित होती है, तब तक अपरिवर्तनीय सिग्नलिंग कैस्केड पहले ही लॉन्च हो चुके होते हैं।

इस समय तक, संधिशोथ के रोगजनन में टीएनएफ की भागीदारी का संकेत देने वाले कई तथ्य पहले ही जमा हो चुके थे, इसलिए इस बीमारी को एंटीएनएफ थेरेपी के लिए अगले संभावित लक्ष्य के रूप में चुना गया था। रुमेटीइड गठिया में इन्फ्लिक्सिमैब के पायलट अध्ययन ने आशाजनक परिणाम दिखाए, और एक और यादृच्छिक, डबल-ब्लाइंड अध्ययन ने ऑटोइम्यून बीमारियों के उपचार में एंटीएनएफ थेरेपी की प्रभावशीलता की पुष्टि की। हालांकि, बार-बार इंजेक्शन लगाने के बाद, कुछ रोगियों में चर डोमेन में माउस अमीनो एसिड अनुक्रमों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी विकसित हुईं, जिससे चिकित्सा की प्रभावशीलता कम हो गई।

एक डबल-ब्लाइंड, यादृच्छिक अध्ययन से पता चला है कि इन्फ्लिक्सिमैब का कम खुराक वाले मेथोट्रेक्सेट के साथ एक सहक्रियात्मक प्रभाव होता है, जो आरए की मोनोथेरेपी के लिए इस्तेमाल की जाने वाली साइटोस्टैटिक दवा है। संयुक्त होने पर, ये दोनों दवाएं अधिक प्रभावी होती हैं और इन्फ्लिक्सिमाब की प्रतिरक्षात्मकता कम हो जाती है। बाद के चरण II/III नैदानिक परीक्षणों से आरए के उपचार के लिए इन्फ्लिक्सिमैब को मंजूरी मिल गई।

इन्फ्लिक्सिमैब की क्रिया का तंत्र मुख्य रूप से प्रणालीगत परिसंचरण में घुलनशील टीएनएफ के बंधन और स्थानीय अतिअभिव्यक्ति (आरए में श्लेष गुहा) के स्थानों पर होता है। लेकिन, इसके अलावा, इन्फ्लिक्सिमैब टीएनएफ के ट्रांसमेम्ब्रेन रूप से बंधने में सक्षम है और एंटीबॉडी-निर्भर साइटोटॉक्सिसिटी के तंत्र के माध्यम से इसे अपनी सतह पर ले जाने वाली कोशिकाओं के लसीका का कारण बनता है।

एंटीएनएफ थेरेपी पैथोलॉजिकल सिग्नलिंग कैस्केड को तोड़ती है और सूजन प्रतिक्रिया में कमी लाती है, लेकिन इसके अलावा, यह अव्यवस्थित प्रतिरक्षा प्रणाली को संतुलित करने में सक्षम है। टीएनएफ अवरोधकों की शुरूआत के साथ, टी-प्रभावक और टी-नियामक कोशिकाओं का संतुलन बदल जाता है।

एंटीएनएफ थेरेपी एटियोट्रोपिक थेरेपी नहीं है और सैद्धांतिक रूप से इसका उपयोग रोगी के पूरे जीवन में किया जाना चाहिए, हालांकि, कुछ मामलों में स्थिर छूट प्राप्त करना संभव है, जो एंटीएनएफ थेरेपी बंद करने के बाद भी बनी रहती है।

टीएनएफ ब्लॉकर्स ने अन्य ऑटोइम्यून और सूजन संबंधी बीमारियों के उपचार में भी अपनी प्रभावशीलता दिखाई है: टीएनएफ को क्रोहन रोग के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है - यह आंत के सूजन वाले क्षेत्रों में अत्यधिक प्रभावित होता है। इन्फ्लिक्सिमैब के साथ मानक चिकित्सा के प्रति प्रतिरोधी क्रोहन रोग के इलाज में प्रारंभिक सफलताओं की बाद में यादृच्छिक नैदानिक परीक्षणों में पुष्टि की गई, जिसके परिणामस्वरूप इस बीमारी के इलाज के लिए इन्फ्लिक्सिमैब को भी मंजूरी दे दी गई।

एंकिलॉज़िंग स्पॉन्डिलाइटिस (एंकिलॉज़िंग स्पॉन्डिलाइटिस) का रोगजनन, एक अन्य पुरानी प्रणालीगत ऑटोइम्यून बीमारी जो मुख्य रूप से जोड़ों को प्रभावित करती है, टीएनएफ की अधिकता के कारण भी होती है। इस बीमारी के लिए इन्फ्लिक्सिमैब का क्लिनिकल परीक्षण भी सफल रहा है। इसके अलावा, एंटीएनएफ थेरेपी ने सोरायसिस और सोरियाटिक गठिया के उपचार में उच्च प्रभावशीलता दिखाई है।

आज तक, इन्फ्लिक्सिमैब और अन्य टीएनएफ ब्लॉकर्स को निम्नलिखित ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए चिकित्सीय एजेंट के रूप में अनुमोदित किया गया है: संधिशोथ, किशोर अज्ञातहेतुक गठिया, एंकिलॉज़िंग स्पॉन्डिलाइटिस, क्रोहन रोग, अल्सरेटिव कोलाइटिस, सोरायसिस, सोरियाटिक गठिया। इसके अलावा, टीएनएफ प्रतिपक्षी ने सारकॉइडोसिस, वेगेनर के ग्रैनुलोमैटोसिस, बेहसेट रोग और अन्य पुरानी बीमारियों के उपचार में सकारात्मक परिणाम दिखाए हैं।

ऐसे संकेत कि टीएनएफ मल्टीपल स्केलेरोसिस के रोगजनन में भूमिका निभाता है, प्रयोगशाला जानवरों पर प्रयोगों द्वारा पुष्टि की गई है। टीएनएफ के प्रशासन ने चूहों में प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस के लक्षणों को बढ़ा दिया, और एंटीएनएफ एंटीबॉडी के प्रशासन ने इस बीमारी के विकास को रोक दिया।

हालाँकि, इन्फ्लिक्सिमैब और एक अन्य टीएनएफ अवरोधक, लेनरसेप्ट (घुलनशील टीएनएफआर1) के साथ मल्टीपल स्केलेरोसिस के उपचार के लिए नैदानिक परीक्षणों ने कोई महत्वपूर्ण नैदानिक प्रतिक्रिया उत्पन्न नहीं की। इसके अलावा, कुछ रोगियों में

एक मॉडल ऑटोइम्यून बीमारी, जिसका रोगजनन मल्टीपल स्केलेरोसिस के रोगजनन के समान है। रोग के नैदानिक लक्षणों में वृद्धि हुई और मस्तिष्कमेरु द्रव में सेलुलरता और इम्युनोग्लोबुलिन के स्तर में वृद्धि हुई, और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग पर घावों की संख्या में वृद्धि हुई।

इन्फ्लिक्सिमैब की सफलता ने टीएनएफआर के माध्यम से सिग्नल ट्रांसमिशन को अवरुद्ध करने में सक्षम नए अणुओं के विकास को गति दी है। इसके अलावा, इन्फ्लिक्सिमाब की भारी और हल्की श्रृंखलाओं के परिवर्तनशील डोमेन में माउस अनुक्रमों ने कुछ रोगियों में द्वितीयक एंटीबॉडी का उत्पादन किया, जिसने इन्फ्लिक्सिमैब के प्रभाव को अवरुद्ध कर दिया और रोगियों को चिकित्सा के लिए प्रतिरोधी बना दिया। इस सीमा को पार करने के लिए, पूरी तरह से मानव अमीनो एसिड अनुक्रमों के साथ अवरोधक बनाने का मार्ग अपनाया गया।

आज तक, इन्फ्लिक्सिमैब के अलावा, चार टीएनएफ प्रतिपक्षी को नैदानिक उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया है (चित्र 2 देखें):

Etanercept एक पुनः संयोजक TNF अवरोधक है जिसे घुलनशील TNFR2 से डिज़ाइन किया गया है। इसका विकास इस डेटा पर आधारित था कि मानव शरीर में दूसरे टीएनएफ रिसेप्टर का घुलनशील रूप मौजूद है। टीएनएफआर2, मेटालोप्रोटीज़ द्वारा "एक्सफ़ोलीएटेड", टीएनएफ गतिविधि के नियमन में एक अतिरिक्त कड़ी है। एटैनरसेप्ट टीएनएफआर2 के बाह्यकोशिकीय भाग का एक डिमर है जो आनुवंशिक रूप से इम्युनोग्लोबुलिन आईजीजीएल के एफसी भाग से जुड़ा हुआ है। एंटीबॉडी स्थिरांक क्षेत्र से जुड़ने से एफसीआरएन रिसेप्टर के माध्यम से प्रोटीन पुनर्चक्रण के कारण प्रणालीगत परिसंचरण में दवा का आधा जीवन काफी बढ़ जाता है। फ़्यूज़न प्रोटीन की निष्क्रिय करने वाली गतिविधि को इन विट्रो और इन विवो दोनों प्रयोगों में प्रदर्शित किया गया था, और बाद में रुमेटीइड गठिया से पीड़ित रोगियों में नैदानिक परीक्षणों में इसकी पुष्टि की गई थी।

हालाँकि, सूजन आंत्र रोगों के उपचार में, इन्फ्लिक्सिमैब के विपरीत, एटैनरसेप्ट ने चिकित्सीय प्रभावकारिता नहीं दिखाई है। एक अन्य टीएनएफ रिसेप्टर, टीएनएफआर1 (पी55) से प्राप्त प्रयोगात्मक टीएनएफ ब्लॉकर वनरसेप्ट, एक यादृच्छिक, प्लेसबो-नियंत्रित, डबल-ब्लाइंड अध्ययन में पायलट नैदानिक अध्ययन को प्रोत्साहित करने के बावजूद, क्रोहन रोग के उपचार में प्रभावशीलता नहीं दिखा पाया। क्रोहन रोग के रोगियों के लैमिना प्रोप्रिया से टी लिम्फोसाइटों की जांच करने वाले एक इन विट्रो अध्ययन से पता चला है कि जबकि इन्फ्लिक्सिमैब और एटैनरसेप्ट दोनों ने टीएनएफ को अवरुद्ध कर दिया था, केवल इन्फ्लिक्सिमैब ने घाव पर टी कोशिकाओं को बांध दिया और उनमें एपोप्टोसिस प्रेरित किया। यह सूजन आंत्र रोगों में एंटीबॉडी-आधारित और पुनः संयोजक रिसेप्टर ब्लॉकर्स की प्रभावशीलता में अंतर को समझा सकता है।

सतह प्लाज्मा अनुनाद का उपयोग करके Vhh41 और मानव TNF के बीच बातचीत का अध्ययन

विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 को एन्कोड करने वाले आनुवंशिक निर्माण को एचएसएच द्वारा एकल-श्रृंखला एंटीबॉडी जीन एएचटी-4 के लिए ऊपर वर्णित के समान 4 प्राइमरों के साथ एक प्रतिक्रिया द्वारा इकट्ठा किया गया था। परिणामी अनुक्रम में शामिल थे: एक एकल-डोमेन एंटीएनएफ एंटीबॉडी जीन, फिर एक लिंकर प्रजाति (ग्लाइ4सेर)3 को एन्कोड करने वाला अनुक्रम, और एक एकल-श्रृंखला एंटी-पी4/80 एंटीबॉडी जीन (कृपया एस. गॉर्डन और एम. स्टेसी द्वारा प्रदान किया गया) . प्रतिबंध एंजाइमों Ncol और Xhol के लिए पहचान साइटों को क्रमशः आगे और रिवर्स प्राइमरों के अनुक्रम में शामिल किया गया था। पीसीआर उत्पाद पर प्रतिबंध लगाने और इसे अभिव्यक्ति वेक्टर पीईटी-28बी (नोवाजेन) में क्लोन करने के बाद, पॉलीहेक्सिडिन टैग को एन्कोड करने वाला अनुक्रम उसी रीडिंग फ्रेम में तीसरे छोर पर पाया गया था। नियंत्रण एंटीबॉडी wA9 प्राप्त करने के लिए, CDR अनुक्रमों के बजाय ग्लाइसीन-सेरीन आवेषण वाले उत्परिवर्ती एंटी-जी 4/80 एससीएफवी जीन को डी-नोवो (जेनेर्ट, जर्मनी) संश्लेषित किया गया था और मूल एंटी-एफ 4/80 जीन के बजाय क्लोन किया गया था (चित्र देखें) .31बी).

रोसेटा2(DE3)pLysS स्ट्रेन (नोवाजेन) की ई. कोली कोशिकाओं को बदलने के लिए A9 और mA9 को एन्कोडिंग करने वाले इंसर्ट वैक्टर का उपयोग किया गया था। निकल-संयुग्मित पेरोक्सीडेज (पियर्स, 15165) का उपयोग करके कॉलोनी इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा सर्वोत्तम उत्पादक क्लोनों का चयन किया गया था। बैक्टीरियल कल्चर को एलबी माध्यम में 50 सीजी/एमएल कार्बेनिसिलिन (सिग्मा-सी1389) और 50 सीजी/एमएल क्लोरैम्फेनिकॉल (सिग्मा-सी1863) से लॉगरिदमिक चरण में उगाया गया, और फिर अभिव्यक्ति 0.2 एमएम आईपीटीजी द्वारा प्रेरित की गई। 4 घंटे के बाद, संस्कृतियों को 30 मिनट के लिए 3200 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। छर्रों को जमे हुए किया गया और फिर लाइसिस बफर (50 मिमी ट्रिसएचसीएल, 300 एमएमएनएसीएल, 5% ग्लिसरॉल, 0.5% ट्राइटन एक्स-100 डिटर्जेंट, 10,000 यू/एमएल लाइसोजाइम, 10 मिमी पी-मर्कैप्टोएथेनॉल) में फिर से निलंबित कर दिया गया और फिर एक अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके बाधित किया गया। लाइसेट्स को 40 मिनट के लिए 17,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और 0.22 सेमी के छिद्र व्यास के साथ एक फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया। विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 और एमए9 को नी-नाइट्रिलोएसेटिक एसिड (इंविट्रोजन आर90115) से संयुग्मित एग्रोसे युक्त क्रोमैटोग्राफिक कॉलम पर साफ़ सतह पर तैरनेवाला से शुद्ध किया गया था। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी का प्रदर्शन किया गया। परिणामी एलुएट को केंद्रित किया गया, फॉस्फेट-बफर खारा के खिलाफ डायलाइज़ किया गया, इसके बाद 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन किया गया। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार समाधान में प्रोटीन सांद्रता को 2,2-बाइसिनकोनिक एसिड (PIERCE 23225 किट) के साथ प्रतिक्रिया का उपयोग करके मापा गया था। परिणामी तैयारी की एकरूपता का परीक्षण सोडियम डोडेसिल सल्फेट की उपस्थिति में 15% पॉलीएक्रिलामाइड जेल में इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा किया गया, इसके बाद कूमैसी स्टेनिंग किया गया।

सतह प्लास्मोन प्रतिध्वनि का उपयोग करके पुनः संयोजक मानव टीएनएफ के साथ एंटीबॉडी ए9 और टीए9 की परस्पर क्रिया।

प्रोटीन XPR36 उपकरण (बायो-रेड) पर पुनः संयोजक मानव TNF के साथ एंटीबॉडी A9 और mA9 की परस्पर क्रिया की समानता और गतिकी की तुलना की गई। सभी अंतःक्रियाओं के मापन के दौरान, 7.4 पीएच वाले फॉस्फेट-बफर खारा का उपयोग किया गया था, जिसमें डिटर्जेंट ट्वीन 20 को 0.005% की सांद्रता में जोड़ा गया था, चिप सतह का तापमान 25 सी था। पुनः संयोजक मानव टीएनएफ को ई में व्यक्त किया गया था। कोलाई पहले वर्णित विधि के अनुसार। 50 एनएम की सांद्रता पर एंटीबॉडी ए9 और टीए9 को एक संशोधित एल्गिनेट पॉलिमर सतह (बायो-रेड 176-5011) के साथ बायोचिप की सतह पर अमीनो समूह के माध्यम से स्थिर किया गया था। फिर पांच दोगुनी घटती सांद्रता (50 -3 एनएम) में विश्लेषण (मानव टीएनएफ) को पांच समानांतर चैनलों में लागू किया गया था। सामान्यीकरण के लिए छठे चैनल में बिना एंटीबॉडी वाला एक बफर पेश किया गया था। प्राप्त सेंसरग्राम का विश्लेषण लैंगमुइर मॉडल का उपयोग करके प्रोटीन मैनेजर प्रोग्राम (बायो-रेड) में किया गया था।

पेरिटोनियल मैक्रोफेज के प्रयोगों में, पेरिटोनियल कोशिकाओं को जंगली-प्रकार (C57BL/6) चूहों से अलग किया गया और फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके तुरंत दाग दिया गया। अस्थि मज्जा मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए, अस्थि मज्जा को अलग किया गया था, जिसके बाद कोशिकाओं को 10 दिनों के लिए वातानुकूलित माध्यम (एल 929 लाइन पर प्राप्त) में सुसंस्कृत किया गया था, फिर कोशिकाओं को बर्फ-ठंडे फॉस्फेट बफर के साथ प्लास्टिक से हटा दिया गया था।

धुंधला होने से पहले, एफसी-गामा रिसेप्टर को अवरुद्ध कर दिया गया था, फिर कोशिकाओं को ए 9 या टीए 9 एंटीबॉडी या बफर के साथ ऊष्मायन किया गया था, जिसके बाद कोशिकाओं को तीन तरीकों में से एक में धोया और दाग दिया गया था: 1) पॉलीक्लोनल खरगोश एंटीबॉडी को एचटीएनएफ-वीएनएच के साथ, फिर के साथ खरगोश आईजीजी के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी फ्लोरोक्रोम से संयुग्मित होते हैं। 2) हेक्साहिस्टिडाइन अनुक्रम (नोवाजेन - 70796) के लिए मोनोक्लोनल माउस एंटीबॉडी, फिर माउस आईजीजी के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक फ्लोरोक्रोम से संयुग्मित। 3) पुनः संयोजक मानव टीएनएफ को कोशिकाओं में जोड़ा गया, और फिर फ्लोरोक्रोम-लेबल मोनोक्लोनल एंटीएनएफ एंटीबॉडी (मिल्टनी बायोटेक - क्लोन: सीए 2)।

इसके अलावा, कोशिकाओं को फ्लोरोक्रोम से संयुग्मित एंटी-पी4/80 और एंटी-सीडी 1 एलबी एंटीबॉडी से रंगा गया था। नमूनों का विश्लेषण एफ एसीएस आरिया (बीडीबायोसाइंसेज) या गुवा ईज़ीसाइट 8एचटी (मिलिपोर) पर किया गया और परिणामी डेटा को फ्लोजो सॉफ्टवेयर (ट्रीस्टार इंक) का उपयोग करके संसाधित किया गया।

मैक्रोफेज की सतह पर मानव टीएनएफ को बनाए रखने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 की क्षमता का मूल्यांकन।

मानव टीएनएफ-उत्पादक चूहों से पेरिटोनियल मैक्रोफेज को अलग किया गया और 96-वेल कल्चर प्लेटों में प्रति कुएं 100 हजार कोशिकाओं पर बीज दिया गया। कोशिकाओं को 37C, 5% CO2 पर 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया, जिसके बाद अनासक्त कोशिकाओं को गर्म फॉस्फेट बफर से धोया गया। फिर कोशिकाओं को रात भर 37C, 5% CO2 पर ऊष्मायन किया गया। 200 μl गर्म DMEM से धोने के बाद, कोशिकाओं को 2 μg/ml की सांद्रता पर A9 एंटीबॉडी के साथ या 37C पर 30 मिनट के लिए DMEM के साथ इनक्यूबेट किया गया। एक और धोने के बाद, कोशिकाओं को 100 एनजी/एमएल की सांद्रता पर एलपीएस (सिग्मा, एल2630) से उत्तेजित किया गया। 4 घंटे के बाद, कल्चर सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एलिसा किट (ईबायोसाइंस, 88-7346) का उपयोग करके मानव टीएनएफ एकाग्रता को मापा गया।

मानव टीएनएफ-उत्पादक चूहों से अस्थि मज्जा को अलग किया गया था, जिसके बाद कोशिकाओं को 10 दिनों के लिए वातानुकूलित माध्यम (एल 929 लाइन पर प्राप्त) में सुसंस्कृत किया गया था, फिर कोशिकाओं को बर्फ-ठंडे फॉस्फेट बफर के साथ प्लास्टिक से हटा दिया गया था। जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना की गई और उन्हें 50,000 कोशिकाओं/वेल की सांद्रता पर 96-वेल प्लेटों में डाला गया। फिर कोशिकाओं को 250 एमएम ए9 एंटीबॉडी या एचटीएनएफ-वीएफएफएच सिंगल-डोमेन एंटीबॉडी या खाली माध्यम (डीएमईएम) के साथ पूरक किया गया। कोशिकाओं को 30 मिनट तक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया। फिर कुओं को फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा से धोया गया। इसके बाद, टीएनएफ उत्पादन को एलपीएस (सिग्मा - एल2630) द्वारा 100 एनजी/एमएल की सांद्रता पर उत्तेजित किया गया। 4 घंटे के बाद, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया, और उनमें टीएनएफ की एकाग्रता को ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के समान प्रोटोकॉल का उपयोग करके एल929 माउस फाइब्रोसारकोमा लाइन पर साइटोटॉक्सिक परीक्षण का उपयोग करके मापा गया था।

फ्लोरोसेंट सेंसर Vhh41-KTNFin इन विट्रो और इन विवो के जैविक गुणों का अध्ययन

माउस उपभेदों से प्राप्त प्रयोगात्मक डेटा के आधार पर जिसमें टीएनएफ जीन को अलग-अलग सेल आबादी में हटा दिया गया है, विभिन्न प्रकार के इम्यूनोसाइट्स द्वारा उत्पादित टीएनएफ के संभावित विभिन्न कार्यों के बारे में एक परिकल्पना तैयार की गई है। इस प्रकार, हाल ही में यह दिखाया गया कि प्रायोगिक तपेदिक संक्रमण के एक मॉडल में, टी लिम्फोसाइट्स द्वारा उत्पादित टीएनएफ, लेकिन मायलोइड कोशिकाओं द्वारा नहीं, एक अद्वितीय सुरक्षात्मक कार्य करता है। इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला ने ऑटोइम्यून बीमारियों में मायलोइड कोशिकाओं से टीएनएफ के रोगजनक गुणों का संकेत देने वाला डेटा प्राप्त किया है। पीएमबी का चिकित्सीय रूप से लागू पूर्ण अवरोधन इन विशेषताओं को ध्यान में नहीं रखता है। इस परिकल्पना के विकास के हिस्से के रूप में, मोनोसाइट-मैक्रोफेज लाइन की कोशिकाओं द्वारा उत्पादित टीएनएफ के विशिष्ट निषेध को चुना गया था, जो इस साइटोकिन के प्रणालीगत अवरोधन पर एक महत्वपूर्ण लाभ हो सकता है। विशेष रूप से, बी और टी लिम्फोसाइटों द्वारा उत्पादित टीएनएफ से एक अक्षुण्ण संकेत साइड इफेक्ट की घटनाओं को कम कर सकता है, और इसके अलावा, एंटी-एनएफ थेरेपी को उन बीमारियों में प्रभावी बनाता है जिनके लिए टीएनएफ ब्लॉकर्स ने पहले कोई नैदानिक प्रभावशीलता नहीं दिखाई है, या यहां तक कि इसका कारण भी बना है। बढ़े हुए लक्षण. इसके अलावा, यह दृष्टिकोण उत्पादक कोशिकाओं को लक्षित वितरण के कारण आवश्यक खुराक को संभावित रूप से कम कर सकता है।

इस धारणा का परीक्षण करने के लिए, हमने एक विशिष्ट एंटीबॉडी का निर्माण और परीक्षण किया, जो एक भाग के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन अणु F4/80 के साथ बातचीत के कारण मैक्रोफेज की सतह से जुड़ जाता है, और दूसरे विशिष्टता के साथ उनके द्वारा उत्पादित टीएनएफ को पकड़ता है और अवरुद्ध करता है।

आणविक क्लोनिंग, विशिष्ट एंटीबॉडी की अभिव्यक्ति और शुद्धि। मैक्रोफेज टीएनएफ के एक चयनात्मक अवरोधक, द्विविशिष्ट एंटीबॉडी को A9 नाम दिया गया था। इसे एन्कोडिंग करने वाले आनुवंशिक निर्माण को बनाने के लिए, एक एकल-डोमेन एंटी-एनएफ अवरोधक एंटीबॉडी hTNF-VffH और मैक्रोफेज सतह मार्कर F4/80 के खिलाफ एक एकल-श्रृंखला एंटीबॉडी (scFv) का उपयोग किया गया था (कृपया एस. गॉर्डन (ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान किया गया) , यूके) और एम. स्टेसी (लीड्स विश्वविद्यालय, यूके) दोनों एंटीबॉडी को एन्कोड करने वाले अनुक्रमों को पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करके बढ़ाया गया था और एक अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया गया था ताकि वे एक ही रीडिंग फ्रेम में हों, और उनके बीच एक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम हो। एक लचीले ग्लाइसिन-सेरीन लिंकर (जीएसजीजीजीजीएसजी) को एन्कोडिंग करके बनाया गया था। अनुक्रम के सी-टर्मिनस पर बाद के प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए एक हिस्टिडीन हेक्सामर को एन्कोडिंग करने वाला एक अनुक्रम होता है (चित्र 31)।

द्विविशिष्ट एंटीबॉडी A9 का डिज़ाइन, इसकी क्रिया के तंत्र का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, द्विविशिष्ट एंटीबॉडी A9 को एन्कोड करने वाले आनुवंशिक निर्माणों की संरचना और नियंत्रण प्रणालीगत TNF अवरोधक एंटीबॉडी tA9। (ए) विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 में मानव टीएनएफ के खिलाफ एक एकल-डोमेन एंटीबॉडी (वीएचएच) और मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज पर व्यक्त सतह अणु एफ4/80 के खिलाफ एक एकल-श्रृंखला एंटीबॉडी (एससीएफवी) शामिल है। (बी) मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित टीएनएफ के चयनात्मक अवरोधन का सिद्धांत: ए9 मैक्रोफेज की सतह से जुड़ जाता है और उनकी सतह से जारी टीएनएफ को पकड़ लेता है, जिससे इसे प्रणालीगत परिसंचरण में प्रवेश करने से रोका जा सकता है। (बी) विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 और नियंत्रण प्रणालीगत टीएनएफ अवरोधक टीए9 के आनुवंशिक डिजाइन की योजना। एकल-डोमेन एंटीएनएफ एंटीबॉडी जीन के बाद एक लचीले ग्लाइसीन-सेरीन लिंकर और फिर एकल-श्रृंखला एंटी-एफ4/80 एंटीबॉडी जीन को एन्कोड करने वाला अनुक्रम होता है। इसके बाद आत्मीयता शुद्धि के लिए हिस्टिडीन हेक्सामर को एन्कोड करने वाला एक अनुक्रम होता है। नियंत्रण एंटीबॉडी tA9 में एक समान अनुक्रम होता है, सिवाय इसके कि एंटी-पी4/80 एंटीबॉडी के 6 हाइपरवेरिएबल क्षेत्रों को (ग्लाइ3सर)एन प्रकार के अनुक्रमों से बदल दिया जाता है, जो एंटीबॉडी को मैक्रोफेज की सतह से जुड़ने से रोकता है और इसे एक में बदल देता है। प्रणालीगत टीएनएफ अवरोधक।

मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित टीएनएफ के विशिष्ट अवरोधन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, एक नियंत्रण प्रणालीगत अवरोधक की आवश्यकता थी। एंटीबॉडी आत्मीयता में अंतर से जुड़े प्रभावों से बचने के लिए, समान A9 TNF-बाध्यकारी साइट वाले अवरोधक का उपयोग करने का निर्णय लिया गया। और अन्य कारकों के प्रभाव को बाहर करने के लिए, विशेष रूप से आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु और आणविक भार, जो आधे जीवन को प्रभावित कर सकते हैं, नियंत्रण एंटीबॉडी को अध्ययन किए जा रहे प्राथमिक अमीनो एसिड अनुक्रम में जितना संभव हो उतना करीब होना चाहिए। इसलिए, हमने एक नियंत्रण एंटीबॉडी - tA9 का निर्माण किया, जिसकी संरचना और अमीनो एसिड अनुक्रम A9 के समान है, सिवाय इसके कि एंटी-P4/80 scFv में इसके 6 हाइपरवेरिएबल क्षेत्रों को फॉर्म (Gly3Ser)n के अनुक्रमों के साथ बदल दिया गया था, मूल सीडीआर क्षेत्रों के समान लंबाई (चित्र 31 बी देखें)।

दोनों एंटीबॉडी को एक जीवाणु प्रणाली में व्यक्त किया गया और एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया।

इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता और एचपीएलसी डेटा द्वारा निर्धारित एंटीबॉडी ए9 का आकार, 45 केडीए (छवि 32) की गणना आणविक द्रव्यमान के अनुरूप है। क्रोमैटोग्राफी बाईं ओर प्रोटीन के आणविक भार हैं। (बी) विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 का क्रोमैटोग्राम (लाल रंग में) आणविक भार मार्करों के क्रोमैटोग्राम पर लगाया गया। (बी) आणविक भार के एक समारोह के रूप में अणु पारगमन समय का कार्य। विशिष्ट एंटीबॉडी A9 का परिकलित आणविक भार 43.4 kDa था।

पुनः संयोजक मानव टीएनएफ के साथ एंटीबॉडी ए9 और टीए9 की परस्पर क्रिया। पुनः संयोजक मानव टीएनएफ के साथ एंटीबॉडी ए9 और टीए9 की परस्पर क्रिया की गतिशीलता को सतह प्लास्मोन अनुनाद द्वारा मापा गया था। ऐसा करने के लिए, 50 एनएम की सांद्रता पर दोनों एंटीबॉडी को सेंसर चिप की सतह पर स्थिर किया गया था, जिसके बाद 50-3 एनएम के क्रमिक कमजोर पड़ने में पुनः संयोजक मानव टीएनएफ को एक विश्लेषक के रूप में लागू किया गया था, और इंटरैक्शन कैनेटीक्स को एक प्रोटीन पर मापा गया था XPR36 डिवाइस. दोनों एंटीबॉडी ने उच्च संबंध दिखाया: A9 और tA9 का Kd क्रमशः 85 और 95 pM था। यह पुष्टि करता है कि शुरू किए गए उत्परिवर्तन ने टीएनएफ बाइंडिंग को प्रभावित नहीं किया है। इसके अलावा, दोनों एंटीबॉडी में बाइंडिंग दर (केफॉरवर्ड, ऑन-रेट) और पृथक्करण दर (क्रेवर्स, ऑफ-रेट) के समान पैरामीटर थे - चित्र में दिखाया गया है। 33 और टैब में. 3. धीमी पृथक्करण दर को एंटीबॉडी ए9 को बाध्य टीएनएफ बनाए रखने की अनुमति देनी चाहिए।

एक नए पुनः संयोजक एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन और लक्षण वर्णन जो विशेष रूप से मानव टीएनएफ से बंधता है लेकिन इसकी जैविक गतिविधि को अवरुद्ध नहीं करता है

पुनः संयोजक मानव टीएनएफ के साथ एंटीबॉडी ए9 और टीए9 की परस्पर क्रिया की गतिशीलता को सतह प्लास्मोन अनुनाद द्वारा मापा गया था। ऐसा करने के लिए, 50 एनएम की सांद्रता पर दोनों एंटीबॉडी को सेंसर चिप की सतह पर स्थिर किया गया था, जिसके बाद 50-3 एनएम के क्रमिक कमजोर पड़ने में पुनः संयोजक मानव टीएनएफ को एक विश्लेषक के रूप में लागू किया गया था, और इंटरैक्शन कैनेटीक्स को एक प्रोटीन पर मापा गया था XPR36 डिवाइस. दोनों एंटीबॉडी ने उच्च संबंध दिखाया: A9 और tA9 का Kd क्रमशः 85 और 95 pM था। यह पुष्टि करता है कि शुरू किए गए उत्परिवर्तन ने टीएनएफ बाइंडिंग को प्रभावित नहीं किया है। इसके अलावा, दोनों एंटीबॉडी में बाइंडिंग दर (केफॉरवर्ड, ऑन-रेट) और पृथक्करण दर (क्रेवर्स, ऑफ-रेट) के समान पैरामीटर थे - चित्र में दिखाया गया है। 33 और टैब में. 3. धीमी पृथक्करण दर को एंटीबॉडी ए9 को बाध्य टीएनएफ बनाए रखने की अनुमति देनी चाहिए।

पुनः संयोजक मानव टीएनएफ के साथ विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 और नियंत्रण एंटीबॉडी टीए9 की परस्पर क्रिया की गतिकी। (ए) एक सेंसर चिप के साथ 50 एनएम - 3 एनएम की सांद्रता पर पुनः संयोजक मानव टीएनएफ के इंटरैक्शन वक्र (सेंसोग्राम) दिखाए गए हैं, जिस पर द्विविशिष्ट एंटीबॉडी ए9 और नियंत्रण एंटीबॉडी टीए9 को स्थिर किया गया था। भुज अक्ष सेकंड में समय दिखाता है, और कोटि अक्ष पारंपरिक इकाइयों (सीयू) में अनुनाद कोण बदलाव दिखाता है। (बी) सेंसरोग्राम के प्रत्येक समूह के लिए, बाइंडिंग दर (ऑप-रेट), पृथक्करण दर (ऑफ-रेट) और पृथक्करण स्थिरांक (केडी) के मूल्यों की गणना की गई। परिणामी औसत मान, साथ ही मानक विचलन (एसडी), आइसोएफ़िनिटी आरेख पर प्लॉट किए जाते हैं। विकर्ण रेखाएँ संकेतित पृथक्करण स्थिरांक मानों के अनुरूप हैं।

टीएनएफ के जैविक प्रभावों को रोकने में एंटीबॉडी ए9 की तुलनात्मक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए, एल929 म्यूरिन फाइब्रोसारकोमा लाइन पर साइटोटॉक्सिक परीक्षण किया गया था। A9 और tA9 एंटीबॉडी के क्रमिक तनुकरण को पुनः संयोजक मानव TNF और एक्टिनोमाइसिन-डी की निरंतर सांद्रता में जोड़ा गया था। प्राप्त आंकड़ों के अनुसार, एंटीबॉडी ए9 और टीए9 में समान एंटीएनएफ गतिविधि है (चित्र 34 ए)। इसके अलावा, यह पुष्टि की गई कि विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 की गतिविधि एकल-डोमेन एंटीएनएफ एंटीबॉडी एचटीएनएफ-वीएफएफएच की गतिविधि से मेल खाती है, जो ए9 और टीए9 (चित्र 34 बी) का हिस्सा है। 10 10 10

विशिष्ट एंटीबॉडी A9, नियंत्रण एंटीबॉडी mA9 और एकल डोमेन एंटीबॉडी hTNF-VffH की एंटीएनएफ गतिविधि। (ए) विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 और नियंत्रण एंटीबॉडी टीए9 की गतिविधि की तुलना। मानव टीएनएफ की निरंतर खुराक और एंटीबॉडी ए9 और एमए9 की घटती खुराक के एक साथ संपर्क के तहत म्यूरिन फाइब्रोसारकोमा एल929 कोशिकाओं का अस्तित्व वक्र प्रस्तुत किया गया है। (बी) विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 और एकल-डोमेन एंटीबॉडी एचटीएनएफ-वीएनएच की गतिविधि की तुलना। मानव TNF की निरंतर खुराक और एंटीबॉडी A9 और hTNF-VHH की घटती खुराक के एक साथ संपर्क के तहत म्यूरिन फाइब्रोसारकोमा L929 कोशिकाओं का अस्तित्व वक्र प्रस्तुत किया गया है। दाढ़ द्रव्यमान में अंतर के प्रभाव को बाहर करने के लिए दाढ़ सांद्रता में तुलना की गई थी एंटीबॉडी की निर्धारित गतिविधि पर.

सतह अणु F4/80 के साथ बातचीत के माध्यम से मैक्रोफेज की सतह पर एंटीबॉडी A9 और tA9 के बंधन का विश्लेषण।

मैक्रोफेज की सतह से विशेष रूप से जुड़ने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 की क्षमता का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। ऐसा करने के लिए, पेरिटोनियल गुहा से पृथक कोशिकाओं को ए9 एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था, जिसके बाद उन्हें मैक्रोफेज मार्कर सीडी1 एलबी और एफ4/80 के लिए दाग दिया गया था, जबकि वीएचएच या एंटीबॉडी के लिए एंटीबॉडी के माध्यम से विशिष्ट ए9 एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट धुंधलापन किया गया था। पॉलीहिस्टिडाइन टैग. फिर नमूनों को फ्लो साइटोमेट्री और विश्लेषण के अधीन किया गया।

इन प्रयोगों से पता चला कि द्विविशिष्ट एंटीबॉडी A9 पेरिटोनियल कोशिकाओं की सतह (मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज) पर F4/80 और CD1 lb को व्यक्त करने में सक्षम है (चित्र 35 ए - डी)। साथ ही, A9 पेरिटोनियल गुहा की उन कोशिकाओं से बंधता नहीं है जिनमें ये मार्कर (मुख्य रूप से लिम्फोसाइट्स) नहीं होते हैं (चित्र 35 ई और एफ)। लक्ष्य से जुड़ने के लिए दो एंटीबॉडी के बीच प्रतिस्पर्धा के कारण ए9 एंटीबॉडी के जुड़ने पर समानांतर एंटी-एफ4/80 स्टेनिंग के स्तर में कमी यह पुष्टि करती है कि ए9 कोशिका की सतह पर इस अणु के साथ विशेष रूप से संपर्क करता है (चित्र 35 जी और 3) .

मास-1 नाम का भी प्रयोग किया जाता है। पूरक प्रणाली के S3 घटक के लिए रिसेप्टर का एक घटक। चूहों में यह मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज और माइक्रोग्लियल कोशिकाओं पर व्यक्त होता है। द्विविशिष्ट एंटीबॉडी

पेरिटोनियल गुहा कोशिकाओं को विशिष्ट एंटीबॉडी ए 9 (लाल रंग में दिखाया गया है) के साथ या उसके बिना ऊष्मायन किया गया था और फिर मोनोसाइट-मैक्रोफेज कोशिकाओं के लिए विशिष्ट सतह मार्करों और ए 9 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट लेबल वाले एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। फिर प्राप्त नमूनों का फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया। (ए, बी, ई, जी) वीएचएच डोमेन के एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना। (बी, डी, ई, 3) पॉलीहेक्सिडिन अनुक्रम के एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना। (ए, बी) विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 एफ4/80 और सीडी1 एलबी (मैक्रोफेज) की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के लिए चयनित कोशिकाओं से जुड़ता है। दिखाए गए हिस्टोग्राम में, क्षैतिज अक्ष A9 पर धुंधला चैनल में प्रतिदीप्ति मान दिखाता है, और ऊर्ध्वाधर अक्ष घटना की घटना की सामान्यीकृत आवृत्ति दिखाता है। (सी, डी) स्कैटर हिस्टोग्राम के रूप में समान। क्षैतिज अक्ष A9 पर स्टेनिंग चैनल में प्रतिदीप्ति मान दिखाता है, और ऊर्ध्वाधर अक्ष F4/80 पर स्टेनिंग चैनल में प्रतिदीप्ति मान दिखाता है। (डी, एफ) - विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 पेरिटोनियल गुहा की कोशिकाओं से बंधता नहीं है जो एफ4/80 और सीडी1 एलबी (लिम्फोसाइट्स) को व्यक्त नहीं करते हैं। दिखाए गए हिस्टोग्राम में, क्षैतिज अक्ष A9 पर धुंधला चैनल में प्रतिदीप्ति मान दिखाता है, और ऊर्ध्वाधर अक्ष घटना की घटना की सामान्यीकृत आवृत्ति दिखाता है। (जी, 3) - द्विविशिष्ट एंटीबॉडी ए9 के साथ ऊष्मायन एफ4/80 के लिए धुंधलापन की तीव्रता को कम कर देता है। दिखाए गए हिस्टोग्राम में, क्षैतिज अक्ष धुंधला चैनल में F4/80 पर प्रतिदीप्ति मान दिखाता है, और ऊर्ध्वाधर अक्ष घटना की घटना की सामान्यीकृत आवृत्ति दिखाता है।

अस्थि मज्जा मैक्रोफेज को विशिष्ट A9 एंटीबॉडी (लाल रंग में दिखाया गया है), इसके बिना (नीले रंग में दिखाया गया है), या नियंत्रण tA9 एंटीबॉडी (काले रंग में दिखाया गया है) के साथ ऊष्मायन किया गया था और फिर A9/tA9-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। प्राप्त नमूनों का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया। (ए) विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 विशेष रूप से अस्थि मज्जा मैक्रोफेज से बांधता है। दिखाए गए हिस्टोग्राम में, क्षैतिज अक्ष A9 पर धुंधला चैनल में प्रतिदीप्ति मान दिखाता है, और ऊर्ध्वाधर अक्ष घटना की घटना की सामान्यीकृत आवृत्ति दिखाता है। (बी) नियंत्रण एंटीबॉडी wA9 अस्थि मज्जा मैक्रोफेज से बंधने में विफल रहता है। दिखाए गए हिस्टोग्राम में, क्षैतिज अक्ष wA9 पर धुंधला चैनल में प्रतिदीप्ति मान दिखाता है, और ऊर्ध्वाधर अक्ष घटना की घटना की सामान्यीकृत आवृत्ति दिखाता है।

इसके अलावा, अतिरिक्त साइटोफ्लोरोमेट्रिक प्रयोगों से पता चला है कि ए9 एंटीबॉडी, जब मैक्रोफेज की सतह से जुड़ा होता है, तो एक साथ बहिर्जात रूप से जोड़े गए मानव टीएनएफ को बांधने में सक्षम होता है (चित्र 37)। यह पुष्टि करता है कि द्विविशिष्ट एंटीबॉडी की दोनों उपइकाइयाँ एक ही समय में कार्यात्मक रूप से सक्रिय हैं, और एक ही समय में दो एंटीजन का बंधन स्थिर रूप से संभव है।

पेरिटोनियल गुहा कोशिकाओं को विशिष्ट एंटीबॉडी ए 9 (लाल रंग में दिखाया गया है) के साथ या उसके बिना ऊष्मायन किया गया था, फिर पुनः संयोजक मानव टीएनएफ के साथ, और फिर मोनोसाइट-मैक्रोफेज कोशिकाओं के लिए विशिष्ट सतह मार्करों के साथ-साथ मानव टीएनएफ के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए फ्लोरोसेंट लेबल वाले एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। प्राप्त नमूनों का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया। (ए) विशिष्ट एंटीबॉडी ए9 मैक्रोफेज की सतह पर मानव टीएनएफ को बनाए रखने में सक्षम है (एफ4/80 और सीडी1 एलबी अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के लिए चयनित कोशिकाएं)। दिखाए गए हिस्टोग्राम में, क्षैतिज अक्ष टीएनएफ धुंधला चैनल में प्रतिदीप्ति मान दिखाता है, और ऊर्ध्वाधर अक्ष घटना की घटना की सामान्यीकृत आवृत्ति दिखाता है। (बी) स्कैटर हिस्टोग्राम फॉर्म में समान डेटा। क्षैतिज अक्ष TNF धुंधला चैनल में प्रतिदीप्ति मान दिखाता है, और ऊर्ध्वाधर अक्ष F4/80 धुंधला चैनल में प्रतिदीप्ति मान दिखाता है।

प्रोटीन इंजीनियरिंग 6 प्रोटीन का अध्ययन करने और नए गुणों के साथ प्रोटीन प्राप्त करने के लिए तरीकों और दृष्टिकोणों का एक सेट मुख्य कार्य न्यूक्लियोटाइड और अमीनो एसिड अनुक्रमों की एक क्लोन लाइब्रेरी बनाएं प्रोटीन फोल्डिंग और कार्यों पर अमीनो एसिड अवशेषों के एकल प्रतिस्थापन के प्रभावों की जांच करें प्रभावी ढंग से संशोधित करने के तरीकों का विकास करें प्रोटीन को आवश्यक गुण प्रदान करने के लिए आवश्यक गुणों वाले प्रोटीन की जांच और चयन के लिए तरीके और दृष्टिकोण विकसित करें

तर्कसंगत डिजाइन तर्कसंगत डिजाइन प्रोटीन के स्थानिक संगठन के बारे में ज्ञान की आवश्यकता अंतर- और अंतर-आणविक इंटरैक्शन के बारे में ज्ञान की आवश्यकता तरीकों और उपकरणों की अपूर्णता एक दिशा जिसका उद्देश्य उनके स्थानिक डिजाइन द्वारा नए प्रोटीन बनाना है

प्रोटीन अणुओं का निर्देशित विकास एक ऐसी दिशा है जिसका उद्देश्य चयन के माध्यम से नए प्रोटीन बनाना है 1 यादृच्छिक अमीनो एसिड अनुक्रमों की एक लाइब्रेरी प्राप्त करना 2 पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं का चयन करना जिसमें कम से कम आवश्यक गुणों की एक छोटी सी डिग्री हो 3 यादृच्छिक उत्परिवर्तन का उपयोग करके प्रोटीन की नई लाइब्रेरी प्राप्त करना जो कि हैं चयन के अगले दौर में या नए प्रोटीन को व्यक्त करने वाले आनुवंशिक रूप से इंजीनियर किए गए निर्माणों का उपयोग करके उपयोग किया जाता है

प्रोटीन अणुओं का निर्देशित विकास (विकल्प) निर्देशित उत्परिवर्तन का उपयोग करके तर्कसंगत रीडिज़ाइन, उत्परिवर्तन का उपयोग करके प्रोटीन सतहों के एंजाइम इंजीनियरिंग के सक्रिय केंद्र में विशिष्ट अमीनो एसिड अवशेषों को प्रतिस्थापित करता है, अमीनो एसिड अवशेषों के आसपास पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के अनुभागों को बदलता है जो एक साथ करीब होते हैं। प्रोटीन ग्लोब्यूल की सतह, लेकिन पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में एक दूसरे से काफी दूरी पर स्थित होती है

निर्दिष्ट गुणों वाले प्रोटीन की स्क्रीनिंग और चयन, यादृच्छिक स्क्रीनिंग, बेहतर स्क्रीनिंग चयन, आवश्यक गुणों की उपस्थिति के लिए प्रत्येक प्रोटीन की जांच की जाती है; लाइब्रेरी से प्रोटीन का चयन यादृच्छिक रूप से होता है; आवश्यक गुणों की उपस्थिति के लिए प्रत्येक प्रोटीन की जांच की जाती है; लाइब्रेरी से प्रोटीन का चयन यादृच्छिक रूप से होता है; यह संभव है यदि लाइब्रेरी बनाने वाली वस्तुएं फेनोटाइपिक रूप से भिन्न होती हैं (उदाहरण के लिए, एंजाइमेटिक गतिविधि की उपस्थिति में); लाइब्रेरी के घटकों के चयनात्मक संरक्षण के लिए स्थितियां बनाई जाती हैं कुछ गुण (फेज, सेल डिस्प्ले); लाइब्रेरी के घटकों के चयनात्मक संरक्षण के लिए स्थितियाँ बनाई जाती हैं; जिनमें कुछ गुण (फेज, सेल डिस्प्ले) होते हैं, बड़ी संख्या में मैक्रोमोलेक्यूल्स के बीच आवश्यक गुणों वाले प्रोटीन का पता लगाना परिणामी क्लोन लाइब्रेरी

फ़ेज़ प्रदर्शन लक्ष्य फ़ेज़ की सतह पर विदेशी प्रोटीन प्रदर्शित करना है। यह विधि 1985 में फिलामेंटस बैक्टीरियोफेज एम 13 के लिए विकसित की गई थी। (जीन pIII और pVIII एक विदेशी सीडीएनए टुकड़े के सम्मिलन के लिए उपयुक्त लक्ष्य स्थल हैं) लक्ष्य फेज की सतह पर विदेशी प्रोटीन को उजागर करना है। यह विधि 1985 में फिलामेंटस बैक्टीरियोफेज एम 13 के लिए विकसित की गई थी। (जीन pIII और pVIII एक विदेशी सीडीएनए टुकड़े के सम्मिलन के लिए उपयुक्त लक्ष्य स्थल हैं) एक हाइब्रिड जीन का निर्माण लक्ष्य प्रोटीन के कोडिंग अनुक्रम और बैक्टीरियोफेज द्वारा फेज लिफाफा प्रोटीन में से एक से होता है; ई. कोली फेज के दौरान संक्रमित होता है संयोजन; हाइब्रिड प्रोटीन फ़ेज़ कण में शामिल होते हैं

फैगमिड हेल्पर फेज फेज जीनोम एक हेल्पर फेज के साथ ई.कोली का संक्रमण ई.कोली कोशिकाओं को एक प्लास्मिड लाइब्रेरी / फेजेमिड के साथ रूपांतरित किया जाता है, फेज कणों को प्राप्त करने के लिए एक सहायक फेज से संक्रमित किया जाता है, जिसकी सतह पर लक्ष्य प्रोटीन के विभिन्न प्रकार उजागर होते हैं। कोलाई कोशिकाएं एक प्लास्मिड लाइब्रेरी/फेजीमिड से रूपांतरित हो जाती हैं, और उन्हें फ़ेज़ कण प्राप्त करने के लिए एक सहायक फ़ेज़ से संक्रमित किया जाता है, जिसकी सतह पर लक्ष्य प्रोटीन के विभिन्न प्रकार उजागर होते हैं।

प्रोटीन इंजीनियरिंग चिकित्सा के व्यावहारिक उपयोग की संभावनाएँ: *नई दवाओं के उत्पादन के लिए; नैदानिक उपकरणों के निर्माण और टीकों के उत्पादन के लिए; *प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के तंत्र, साथ ही प्रतिरक्षा प्रणाली पारिस्थितिकी के रोगों का अध्ययन करने के लिए: *उनकी सतह पर स्थिर एंजाइमों के साथ संपूर्ण कोशिकाओं के रूप में जैव उत्प्रेरक प्राप्त करने के लिए; *निदान और पर्यावरण निगरानी के लिए बायोसेंसर प्राप्त करने के लिए; *पर्यावरण से विषाक्त पदार्थों और भारी धातु आयनों को हटाने के लिए जैव अवशोषक के निर्माण के लिए

एक एंजाइम इलेक्ट्रोड का उपयोग करके ग्लूकोज को मापना (एल. क्लार्क के प्रयोग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व)। ऑक्सीजन की उपस्थिति में एंजाइम ग्लूकोज ऑक्सीडेज द्वारा ग्लूकोज का ऑक्सीकरण: ग्लूकोज + ओ 2 एच 2 ओ 2 + ग्लूकोनो-1,5-लैक्टोन। प्लैटिनम इलेक्ट्रोड पर H 2 O 2 को +700 mV की क्षमता पर कम किया जाता है; सर्किट में प्रवाहित धारा हाइड्रोजन पेरोक्साइड (यानी, अप्रत्यक्ष रूप से, ग्लूकोज) की सांद्रता के समानुपाती होती है।

डिक्शनरी एल्यूशन एल्यूशन एक ठोस वाहक से किसी पदार्थ (वायरस) को धोकर निकालने की एक विधि है। डिस्प्ले विधि, डिस्प्ले विधि प्रोटीन या पेप्टाइड्स का चयन करने के लिए वायरस, कोशिकाओं या सेल-मुक्त संस्कृतियों की सतह पर विषम प्रोटीन/पेप्टाइड्स पेश करने की एक विधि है। आवश्यक गुणों के साथ बायोसेंसर बायोसेंसर - विश्लेषणात्मक प्रणाली (जैविक सामग्री + कनवर्टर), जो परीक्षण नमूने में पदार्थों का पता लगाना और उनकी सांद्रता का अनुमान लगाना संभव बनाता है एल्यूशन एल्यूशन एक ठोस वाहक से पदार्थ (वायरस) को धोकर निकालने की एक विधि है प्रदर्शन विधि प्रदर्शन विधि आवश्यक गुणों के साथ प्रोटीन या पेप्टाइड का चयन करने के लिए वायरस, कोशिकाओं या सेल-मुक्त संस्कृतियों की सतह पर विषम प्रोटीन/पेप्टाइड पेश करने की एक विधि है बायोसेंसर बायोसेंसर एक विश्लेषणात्मक प्रणाली (जैविक सामग्री + कनवर्टर) है जो आपको अनुमति देता है परीक्षण नमूने में पदार्थों का पता लगाएं और उनकी सांद्रता का अनुमान लगाएं

प्रोटीन इंजीनियरिंग 4 प्रोटीन का अध्ययन करने और नए गुणों के साथ प्रोटीन प्राप्त करने के लिए तरीकों और दृष्टिकोणों का एक सेट मुख्य कार्य न्यूक्लियोटाइड और अमीनो एसिड अनुक्रमों की एक क्लोन लाइब्रेरी बनाएं प्रोटीन फोल्डिंग और कार्यों पर अमीनो एसिड अवशेषों के एकल प्रतिस्थापन के प्रभावों की जांच करें प्रभावी ढंग से संशोधित करने के लिए तरीकों का विकास करें प्रोटीन को आवश्यक गुण प्रदान करने के लिए आवश्यक गुणों वाले प्रोटीन की जांच और चयन के लिए तरीके और दृष्टिकोण विकसित करें

शब्दावली स्थिरीकरण स्थिरीकरण अणुओं की गतिशीलता और उनकी पुष्टिकरण पुनर्व्यवस्था का प्रतिबंध है एयरोटैंक एरोटैंक एक अपशिष्ट जल उपचार प्रणाली है, जलाशय जिसमें एसडब्ल्यू, माइक्रोबियल कीचड़ और हवा का मिश्रण होता है डाइजेस्टर डाइजेस्टर डाइजेस्टर बैक्टीरिया का उपयोग करके कार्बनिक प्रदूषकों के जैविक प्रसंस्करण के लिए एक जलाशय है अवायवीय परिस्थितियों में बायोरेमेडिएशन बायोरेमेडिएशन जैविक वस्तुओं - पौधों, कवक, कीड़े, कीड़े और अन्य जीवों की चयापचय क्षमता का उपयोग करके पानी, मिट्टी और वायुमंडल के शुद्धिकरण के तरीकों का एक सेट है स्थिरीकरण स्थिरीकरण अणुओं की गतिशीलता और उनकी पुष्टिकरण पुनर्व्यवस्था की एक सीमा है एरोटैंक एरोटैंक एक अपशिष्ट जल उपचार प्रणाली है, जलाशय जिसमें एसडब्ल्यू, माइक्रोबियल कीचड़ और वायु का मिश्रण होता है डाइजेस्टर डाइजेस्टर अवायवीय परिस्थितियों में बैक्टीरिया का उपयोग करके कार्बनिक प्रदूषकों के जैविक प्रसंस्करण के लिए एक जलाशय है बायोरेमेडिएशन बायोरेमेडिएशन पानी, मिट्टी और को शुद्ध करने के तरीकों का एक सेट है जैविक वस्तुओं - पौधों, कवक, कीड़े, कीड़े और अन्य जीवों की चयापचय क्षमता का उपयोग करके वातावरण

एंजाइमों का वर्गीकरण वर्ग उत्प्रेरित प्रतिक्रियाएं एंजाइमों के उदाहरण ऑक्सीडोरडक्टेस रिडक्टिव और ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रियाएं 200 से अधिक एंजाइम ज्ञात हैं। कैटालेज, ग्लूकोज ऑक्सीडेज ट्रांसफरेज, दाताओं से स्वीकर्ता तक परमाणुओं के समूहों का प्रतिवर्ती स्थानांतरण। 450 से अधिक एंजाइम ज्ञात हैं। पाइरूवेट काइनेज, प्रोटीन काइनेज हाइड्रोलेज हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रियाएं 200 से अधिक हाइड्रोलेज ज्ञात हैं। प्रोटीज़, एमाइलेज़, सेल्यूलेज़ लाइसेज़, दोहरे बंधन बनाने के लिए सब्सट्रेट से परमाणुओं के समूहों का गैर-हाइड्रोलाइटिक दरार। 100 से अधिक लाइसेज़ ज्ञात हैं। एस्पार्टेज़, फ्यूमरेज़ आइसोमेरेज़ कार्बनिक यौगिकों की पुनर्व्यवस्था की इंट्रामोल्युलर प्रतिक्रियाएं 50 से अधिक एंजाइम ज्ञात हैं। ग्लूकोज इमेरेज़ लिगेज़ दो अलग-अलग अणुओं के एक दूसरे से जुड़ने की प्रतिक्रियाएं 100 से अधिक ज्ञात हैं। डीएनए लिगेज, ट्रिप्टोफैन सिंथेटेज़

सूक्ष्मजीव एंजाइमों के स्रोत हैं बैसिली राइबोन्यूक्लिअस, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिअस और प्रोटीज के बायोसिंथेसाइज़र हैं, और यीस्ट ग्लूकोमाइलेज, इनवर्टेस और एसिड फॉस्फेट पौधे हैं। एमाइलेज को जौ से, एसिड फॉस्फेट को आलू से, पेरोक्सीडेज को हॉर्सरैडिश जानवरों से, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज को मवेशियों के दिल से अलग किया जाता है, क्षारीय। फॉस्फेट को पेट से अलग किया जाता है। सूअरों के पेट का उपयोग पेप्सिन प्राप्त करने के लिए किया जाता है। लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज को मवेशियों के हृदय से अलग किया जाता है, और क्षारीय फॉस्फेट को पेट से अलग किया जाता है। सुअर के पेट का उपयोग पेप्सिन के उत्पादन के लिए किया जाता है

स्थिरीकरण के तरीके भौतिक तरीके रासायनिक तरीके एक अघुलनशील वाहक पर सोखना, एक जेल के छिद्रों में शामिल करना, एक अर्ध-पारगम्य झिल्ली का उपयोग करके स्थानिक पृथक्करण और अन्य एंजाइम और वाहक के बीच नए सहसंयोजक बंधन के निर्माण पर आधारित हैं

स्थिर एंजाइमों के लाभ प्रतिक्रिया माध्यम से एंजाइमों को अलग करना, सही समय पर प्रतिक्रिया को रोकना और एंजाइम से दूषित न होने वाला उत्पाद प्राप्त करना है; प्रक्रिया को निरंतर मोड में पूरा करें और प्रतिक्रिया दर को नियंत्रित करें; उत्प्रेरक के गुणों, उसकी विशिष्टता, प्रतिक्रिया स्थितियों पर निर्भरता और विकृतीकरण प्रभावों के प्रति संवेदनशीलता को बदलना; वाहक को प्रभावित करके एंजाइम की उत्प्रेरक गतिविधि को विनियमित करें

जैव प्रौद्योगिकी उत्पादन में एंजाइम एंजाइम स्रोत, स्थिरीकरण विधि जैव प्रौद्योगिकी एसिटाइल न्यूट्रामिनेट -9-फॉस्फेट सिंथेज़ एंजाइम ई. कोलाई। पॉलीएक्रिलामाइड जेल में समावेशन। सियालिक एसिड का संश्लेषण. हॉर्सरैडिश से पेरोक्सीडेज एंजाइम। कोपोलिमराइजेशन और जेल में एल्गिनेट का समावेश। अपशिष्ट जल में फिनोल का ऑक्सीकरण। 3-केटोस्टेरॉइड डिहाइड्रोजनेज माइकोबैक्टीरियम ग्लोबिफॉर्मिस कोशिकाएं। पॉलीएक्रिलामाइड जेल में समावेशन। हाइड्रोकार्टिसोन का प्रेडनिसोलोन में परिवर्तन

लावरीशिना एम.बी. केएमएसयू पर्यावरण जैव प्रौद्योगिकी के तरीके जैविक अपशिष्ट जल उपचार जैव (फाइटो) उपचार जैव सुरक्षित कीटनाशकों और जड़ी-बूटियों का निर्माण जैव सुरक्षित कीटनाशकों और जड़ी-बूटियों का निर्माण पर्यावरण के अनुकूल ऊर्जा का उत्पादन रोग प्रतिरोधी कृषि पौधों का निर्माण धातुओं का जीवाणु लीचिंग लुप्तप्राय और विलुप्त पशु प्रजातियों की क्लोनिंग

अपशिष्ट जल उपचार के तरीके यांत्रिक (निपटान, निस्पंदन) यांत्रिक रासायनिक (अभिकर्मकों के संपर्क में) रासायनिक भौतिक-रासायनिक जैविक (जैव रासायनिक आत्म-शुद्धि) जैविक जैव प्रौद्योगिकी की सबसे महत्वपूर्ण समस्या अपशिष्ट जल उपचार है

एरोटैंक एक होमोजेनाइज़र, सेटलिंग टैंक, एक कीचड़ पुनर्योजी और एक कीचड़ कम्पेक्टर (प्रेस) के साथ मिलकर काम करते हैं। एयरोटैंक एरोटैंक (एयरो और अंग्रेजी टैंक टैंक, टैंक से) सेटलिंग टैंक होमोजेनाइजर एयरोटेन्क कीचड़ पुनर्योजी प्रेस शुद्ध अपशिष्ट जल सक्रिय कीचड़ अपशिष्ट जल डाइजेस्टर

डाइजेस्टर डाइजेस्टर (मीथेन और अंग्रेजी टैंक से - टैंक, टैंक) बैक्टीरिया के समूह प्रारंभिक पदार्थ उत्पाद हाइड्रोलाइटिक एसीटोजेनिक कार्बनिक प्रदूषक उच्च फैटी एसिड हाइड्रोजन उच्च फैटी एसिड का उत्पादन एच 2, सीओ 2, सीएच 3 सीओओएच मीथेन बनाने वाला एच 2, सीओ 2, सीएच 3 कूह सीएच 4, सीओ 2

मीथेन किण्वन के चरण 1 पॉलिमर का बायोहाइड्रोलिसिस और एसिडोजेनेसिस (कार्बनिक पदार्थ उच्च फैटी एसिड, एसीटेट और हाइड्रोजन में परिवर्तित हो जाते हैं) 2 एसीटोजेनेसिस और डिहाइड्रोजनेशन (उच्च फैटी एसिड से एसीटेट और हाइड्रोजन बनते हैं) 3 मेथेनोजेनेसिस (मीथेन, हाइड्रोजन और कार्बन डाइऑक्साइड बनते हैं) एसीटेट से)

चरण 1। सेलूलोज़-नष्ट करने वाला (बैक्टीरियोइड्स रुमिनिकोला, ब्यूटिरिविब्रियो फ़ाइब्रियोसॉल्वेंस) प्रोटीयोलाइटिक प्रोटीयोलाइटिक (क्लोस्ट्रीडियम, पेट्रोकोकस) चरण II। एसीटोजेनिक (सिंट्रोफोबैक्टर वोलिनी) III चरण। मीथेन बनाने वाला (मेटानोबैक्टीरियम थर्मोआटोट्रॉफ़िकम, मेटानोकोकस वैनिएली) सूक्ष्मजीवों के उदाहरण

बायोरेमेडिएशन विधि जटिल कार्बनिक पदार्थों को सरल "जैविक रूप से सुरक्षित" पदार्थों में विघटित करके उपयोग करने की सूक्ष्मजीवों की क्षमता पर आधारित है। आणविक जीव विज्ञान और आनुवंशिकी पारिस्थितिकी इंजीनियरिंग विज्ञान माइक्रोबायोलॉजीबायोरेमेडिएशन

बायोरेमेडिएशन। दृष्टिकोण. प्राकृतिक "जंगली" सूक्ष्मजीवों की गतिविधि का उपयोग करना प्राकृतिक "जंगली" सूक्ष्मजीवों की गतिविधि का उपयोग करना (एक गहनता की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए ओ 2) तीव्र प्रदूषण वाले स्थानों पर जैविक उत्पादों के रूप में पेश किए गए सक्रिय उपभेदों का उपयोग करना

दूषित क्षेत्रों की जैव विविधता का अध्ययन, हटाए गए प्रदूषकों को नष्ट करने में सक्षम माइक्रोफ्लोरा का अलगाव, स्थानीय माइक्रोफ्लोरा (बायोस्टिम्यूलेशन) का सक्रियण। दूषित क्षेत्रों में विशेष सूक्ष्मजीव-विनाशकों का परिचय (बायोरेमेडिएशन) बायोरेमेडिएशन। चरण.

संदूषण रासायनिक विश्लेषण इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियां बायोस्टिम्यूलेशन (प्राकृतिक माइक्रोबियल समुदाय) बायोस्टिम्यूलेशन बायोरेमेडिएशन (कृत्रिम माइक्रोबियल जैविक उत्पाद) बायोरेमेडिएशन बायोरेमेडिएशन मॉनिटरिंग बायोफाइटोरेमेडिएशन (पौधों और सूक्ष्मजीवों के समुदाय) बायोफाइटोरेमेडिएशन

कीटों के प्रति प्रतिरोधी ट्रांसजेनिक पौधों का निर्माण 1. विशिष्ट विषाक्त पदार्थों का संश्लेषण 2. कीड़ों के लार्वा और अन्य कीटों और रोगजनकों / चिटिनास की कोशिका दीवारों पर काम करने वाले हाइड्रोलाइटिक एंजाइमों का संश्लेषण, -1,3- ग्लूकोनेस, पीआर-प्रोट्स / 3. संश्लेषण प्रोटीन अवरोधकों और एंजाइमों के अवरोधक जो पौधों के पॉलीसेकेराइड को तोड़ते हैं 4. पौधों के द्वितीयक चयापचय में संशोधन: ए) आवश्यक पदार्थों की सीमा बी) नए रिपेलेंट्स और विषाक्त पदार्थों का संश्लेषण 5. रक्षा प्रतिक्रिया का विनियमन: ए) टी कैनस्पेसिफिक जीन अभिव्यक्ति बी) विभिन्न प्राकृतिक और कृत्रिम कारकों द्वारा जीन अभिव्यक्ति का विनियमन फंगल रोगज़नक़ फोमोप्सिस हेलियानही के लिए ट्रांसजेनिक पौधों के प्रतिरोध में वृद्धि फंगल रोगज़नक़ फोमोप्सिस हेलियानही के लिए ट्रांसजेनिक पौधों के प्रतिरोध में वृद्धि बी ए - गैर-ट्रांसजेनिक पौधा बी - ट्रांसजेनिक पौधा ए - गैर-ट्रांसजेनिक पौधा बी - ट्रांसजेनिक पौधा

परीक्षण के लिए परीक्षण में शामिल विषयों की अनुमानित सूची 1. जैव प्रौद्योगिकी का इतिहास। ऐतिहासिक काल की विशेषताएँ. सबसे महत्वपूर्ण खोजें जिन्होंने विज्ञान के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई। 2. जैव प्रौद्योगिकी की सामान्य अवधारणाएँ: जैव प्रौद्योगिकी प्रणाली, जैव प्रौद्योगिकी प्रक्रिया, जैव प्रौद्योगिकी वस्तु। 3. जैव प्रौद्योगिकी वस्तुएं, परिभाषा, जैव प्रौद्योगिकी प्रणाली में जैविक वस्तु के स्थान की विशेषताएं, वर्गीकरण, व्यावहारिक अनुप्रयोग के उदाहरण। 4. जैविक वस्तुओं के रूप में सूक्ष्मजीव। उदाहरण, जैव प्रौद्योगिकी में व्यावहारिक उपयोग। 5. जैविक वस्तुओं के रूप में कोशिका और ऊतक संवर्धन। उदाहरण, जैव प्रौद्योगिकी में व्यावहारिक उपयोग। 6. जैव प्रौद्योगिकी प्रक्रिया. चरण. जैव प्रौद्योगिकी प्रक्रिया के चरणों का संक्षिप्त विवरण। 7. चयन की वस्तुओं के रूप में सूक्ष्मजीवों के लक्षण। जैव प्रौद्योगिकी में सूक्ष्मजीवों का चयन. 8. उत्परिवर्तन: परिभाषा, उत्परिवर्तन के रूप, उत्परिवर्तन कारक। 9. जैव प्रौद्योगिकी प्रक्रिया के प्रारंभिक चरण में चयन प्रक्रिया के दौरान निर्मित उत्परिवर्ती सूक्ष्मजीवों का चयन। 10. जैविक वस्तुओं का चयन. चरण, दृष्टिकोण, विधियाँ।

11. जेनेटिक इंजीनियरिंग: उद्देश्य, प्रौद्योगिकी, जैविक वस्तुएं, व्यावहारिक अनुप्रयोग के उदाहरण, आधुनिक उपलब्धियां। 12. जेनेटिक इंजीनियरिंग एंजाइम। वर्गीकरण, उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं की विशेषताएं। 13. जेनेटिक इंजीनियरिंग में जीन प्राप्त करने की विधियाँ। तरीकों का संक्षिप्त विवरण, फायदे और नुकसान। 14. जेनेटिक इंजीनियरिंग में वेक्टर। परिभाषा, वर्गीकरण, आवश्यकताएँ, वैक्टर की संक्षिप्त विशेषताएँ। 15. पुनः संयोजक डीएनए. जेनेटिक इंजीनियरिंग में पुनः संयोजक डीएनए प्राप्त करने की परिभाषा, उद्देश्य, तरीके। 16. प्राप्तकर्ता कोशिका में पुनः संयोजक डीएनए डालने की विधियाँ और आनुवंशिक इंजीनियरिंग में संशोधित कोशिकाओं का चयन। 17. पौधों का ट्रांसजेनेसिस। वेक्टर। बुनियादी रणनीतियाँ. ट्रांसजीन पेश करने और ट्रांसजेनिक जीवों का चयन करने की विधियाँ। 18. पशु ट्रांसजेनेसिस। वेक्टर। बुनियादी रणनीतियाँ. ट्रांसजीन पेश करने और ट्रांसजेनिक जीवों का चयन करने की विधियाँ। 19. सेलुलर इंजीनियरिंग: उद्देश्य, प्रौद्योगिकी, जैविक वस्तुएं, व्यावहारिक अनुप्रयोग के उदाहरण, आधुनिक उपलब्धियां। 20. पौधों की कोशिकाओं और ऊतकों को विकसित करने की विधियाँ। सेल इंजीनियरिंग में खेती की स्थिति, वर्गीकरण और पौधों की संस्कृतियों की संक्षिप्त विशेषताएं

21. दैहिक पादप संकर। उत्पादन तकनीक, आधुनिक उपलब्धियाँ, व्यावहारिक अनुप्रयोग के उदाहरण। 22. प्रोटोप्लास्ट: परिभाषा, सेल इंजीनियरिंग में उपयोग, प्रोटोप्लास्ट को अलग करने की विधियाँ और शर्तें। 23. सेल इंजीनियरिंग में प्रोटोप्लास्ट का संवर्धन और संलयन। तरीके, स्थितियाँ, फ़्यूज़ोजेन। 24. कोशिका एवं पादप ऊतक संवर्धन का व्यावहारिक उपयोग। जैवसंश्लेषण और जैवपरिवर्तन, सूक्ष्मप्रवर्धन, मूल्यवान गुणों वाले ट्रांसजेनिक पौधों के उदाहरण। 25. पशु कोशिका इंजीनियरिंग. विधियाँ, वस्तुएँ, प्रौद्योगिकी, आधुनिक उपलब्धियाँ, व्यावहारिक अनुप्रयोग। 26. पशु कोशिका और ऊतक संवर्धन। फसलों का वर्गीकरण, खेती की स्थितियाँ, मीडिया, दैहिक संकर प्राप्त करने की विधियाँ, व्यावहारिक अनुप्रयोग। 27. स्टेम कोशिकाएँ। विशेषता. वर्गीकरण. आवेदन की संभावनाएँ. 28. क्लोनिंग. विधि की विशेषताएँ. वर्गीकरण. आवेदन की संभावनाएँ. 29. जैव प्रौद्योगिकी प्रक्रिया. खेती का चरण. मुख्य चरण, सूक्ष्मजीवों, पौधों और पशु कोशिकाओं के लिए मीडिया की विशेषताएं। उपकरण। 30. जैव प्रौद्योगिकी प्रक्रिया. खेती का चरण. जैविक वस्तुओं की खेती के तरीके। बायोरिएक्टर में संस्कृति विकास के चरण, लक्ष्य उत्पाद का संश्लेषण।

31. जैव प्रौद्योगिकी प्रक्रिया. उत्पाद प्राप्ति चरण. जैव प्रौद्योगिकी उत्पाद के पृथक्करण और शुद्धिकरण के मुख्य चरण और तरीके। जैव प्रौद्योगिकी उत्पादों के उदाहरण. 32. पर्यावरण जैव प्रौद्योगिकी: उद्देश्य, विधियाँ, जैविक वस्तुएँ, व्यावहारिक अनुप्रयोग के उदाहरण, आधुनिक उपलब्धियाँ। 33. पर्यावरण जैव प्रौद्योगिकी. पीने के पानी की समस्या. अपशिष्ट जल उपचार की एरोबिक विधियाँ। 34. पर्यावरण जैव प्रौद्योगिकी। पीने के पानी की समस्या. अपशिष्ट जल उपचार की अवायवीय विधियाँ। 35. पर्यावरण जैव प्रौद्योगिकी. बायोरेमेडिएशन, बायोफाइटोरेमेडिएशन। 36. जैव प्रौद्योगिकी: लक्ष्य, विषय, उद्देश्य, जैव प्रौद्योगिकी की मुख्य दिशाएँ। जैव प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में आधुनिक उपलब्धियाँ। 37. इंजीनियरिंग एंजाइमोलॉजी. लक्ष्य, समस्याएँ. संभावनाओं। एंजाइमों के स्रोत. 38. स्थिर एंजाइम। लाभ, स्थिरीकरण के तरीके। 39. स्थिर एंजाइम। स्थिरीकरण, व्यावहारिक उपयोग के लिए वाहक। 40. प्रोटीन इंजीनियरिंग. दिशाएँ, विधियाँ, संभावनाएँ।

जेनेटिक इंजीनियरिंग कार्यात्मक रूप से सक्रिय आनुवंशिक संरचनाओं (पुनः संयोजक डीएनए) का इन विट्रो निर्माण है, या दूसरे शब्दों में, कृत्रिम आनुवंशिक कार्यक्रमों (बाएव ए.ए.) का निर्माण है। ई.एस. के अनुसार पिरुज़ियन जेनेटिक इंजीनियरिंग प्रायोगिक तकनीकों की एक प्रणाली है जो तथाकथित पुनः संयोजक या हाइब्रिड डीएनए अणुओं के रूप में प्रयोगशाला में (इन विट्रो में) कृत्रिम आनुवंशिक संरचनाओं का निर्माण करना संभव बनाती है।

जेनेटिक इंजीनियरिंग कोशिका के बाहर न्यूक्लिक एसिड अणुओं के हेरफेर द्वारा आनुवंशिक सामग्री के नए संयोजनों का उत्पादन है और निर्मित जीन संरचनाओं को एक जीवित जीव में स्थानांतरित करना है, जिसके परिणामस्वरूप इस जीव और इसकी संतानों में उनका समावेश और गतिविधि होती है। . हम एक पूर्व निर्धारित कार्यक्रम के अनुसार, शरीर के बाहर आणविक आनुवंशिक प्रणालियों के निर्माण के साथ-साथ एक जीवित जीव में उनके परिचय के बारे में बात कर रहे हैं। इस मामले में, पुनः संयोजक डीएनए प्राप्तकर्ता जीव के आनुवंशिक तंत्र का एक अभिन्न अंग बन जाता है और इसे नए अद्वितीय आनुवंशिक, जैव रासायनिक और फिर शारीरिक गुण प्रदान करता है।

अनुप्रयुक्त आनुवंशिक इंजीनियरिंग का लक्ष्य ऐसे पुनः संयोजक डीएनए अणुओं को डिजाइन करना है, जो आनुवंशिक तंत्र में पेश किए जाने पर, शरीर को मनुष्यों के लिए उपयोगी गुण प्रदान करेंगे। उदाहरण के लिए, "जैविक रिएक्टरों" का उत्पादन - सूक्ष्मजीव, पौधे और जानवर जो ऐसे पदार्थों का उत्पादन करते हैं जो मनुष्यों के लिए औषधीय रूप से महत्वपूर्ण हैं, मनुष्यों के लिए मूल्यवान कुछ गुणों के साथ पौधों की किस्मों और जानवरों की नस्लों का निर्माण। जेनेटिक इंजीनियरिंग पद्धतियाँ आनुवंशिक प्रमाणन करना, आनुवंशिक रोगों का निदान करना, डीएनए टीके बनाना और विभिन्न रोगों के लिए जीन थेरेपी का संचालन करना संभव बनाती हैं।

पुनः संयोजक डीएनए तकनीक निम्नलिखित विधियों का उपयोग करती है:

प्रतिबंध न्यूक्लियस द्वारा डीएनए की विशिष्ट दरार, व्यक्तिगत जीन के अलगाव और हेरफेर को तेज करना;

शुद्ध डीएनए टुकड़े में सभी न्यूक्लियोटाइड का तेजी से अनुक्रमण, जो जीन की सीमाओं और इसके द्वारा एन्कोड किए गए अमीनो एसिड अनुक्रम को निर्धारित करना संभव बनाता है;

पुनः संयोजक डीएनए का निर्माण;

न्यूक्लिक एसिड संकरण, जो पूरक न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमों को बांधने की उनकी क्षमता के आधार पर, अधिक सटीकता और संवेदनशीलता के साथ विशिष्ट आरएनए या डीएनए अनुक्रमों का पता लगाने की अनुमति देता है;

डीएनए क्लोनिंग: पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग करके इन विट्रो प्रवर्धन या एक जीवाणु कोशिका में डीएनए टुकड़े की शुरूआत, जो इस तरह के परिवर्तन के बाद, इस टुकड़े को लाखों प्रतियों में पुन: पेश करता है;

कोशिकाओं या जीवों में पुनः संयोजक डीएनए का परिचय।

पुनः संयोजक अणुओं का निर्माण कई एंजाइमों का उपयोग करके किया जाता है - मुख्य रूप से प्रतिबंध एंजाइम। वर्तमान में, 400 से अधिक विभिन्न प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग किया जाता है। ये एंजाइम विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों द्वारा संश्लेषित होते हैं।

प्रतिबंध एंजाइम डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए अणु में विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों को पहचानते हैं और विभाजित करते हैं। हालाँकि, अकेले प्रतिबंध एंजाइम आणविक क्लोनिंग के लिए पर्याप्त नहीं हैं क्योंकि चिपचिपे सिरे बनाने वाले चार आधारों के बीच हाइड्रोजन बंधन दो डीएनए टुकड़ों को एक साथ रखने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं हैं।

पुनः संयोजक डीएनए अणु के एक भाग में वांछित जीन होता है जिसे क्लोन किया जाना चाहिए, दूसरे में कोशिका में पुनः संयोजक डीएनए की प्रतिकृति के लिए आवश्यक जानकारी होती है।

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